Évaluation toxicologique des alliages métalliques nanocristallins avec des applications potentielles dans le domaine aéronautique

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 1523 (2022) Citer cet article

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Le développement de nouveaux alliages candidats aux caractéristiques exceptionnelles pour leur utilisation dans le domaine aéronautique est l'une des principales priorités du secteur. Dans ce contexte, les alliages nanocristallins (nc) sont considérés comme des matériaux pertinents en raison de leurs caractéristiques particulières, telles que leurs propriétés physiques et mécaniques exceptionnelles. Cependant, un autre point important qui doit être pris en compte avec les alliages nouvellement développés est l'impact toxicologique potentiel que ces matériaux peuvent avoir sur les humains et d'autres organismes vivants. L'objectif de ce travail était de réaliser une évaluation toxicologique préliminaire de trois alliages métalliques nc (WCu, WAl et TiAl) sous forme de poudre produits par mécanosynthèse, en appliquant différents essais in vitro, y compris un mélange de poudres de W-Cu avec une granulométrie standard dans les expériences pour établir des comparaisons. Les effets de l'exposition directe aux suspensions de poudre et/ou à leurs lixiviats dérivés ont été analysés chez trois organismes modèles représentatifs des expositions humaines et environnementales (la lignée cellulaire épithéliale basale alvéolaire humaine adénocarcinome A549, la levure Saccharomyces cerevisiae et la bactérie Gram négative Vibrio fischeri ). Dans l'ensemble, les résultats obtenus fournissent de nouvelles informations sur les effets nocifs potentiels des alliages nc sélectionnés, montrant que, d'un point de vue toxicologique, nc TiAl est le candidat le plus sûr dans les organismes modèles et les conditions testées.

Le concept de matériaux nanocristallins (nc), qui a été introduit pour la première fois par Gleiter1, dans le cas particulier des alliages, fait référence à un métal présentant une taille de grain moyenne à l'échelle nanométrique, cette valeur étant inférieure à 100 nm. Les propriétés mécaniques, chimiques et physiques extraordinaires que présentent ces matériaux ont attiré l'attention de la communauté scientifique et, par conséquent, les métaux non métalliques ont fait l'objet d'intenses recherches interdisciplinaires2,3,4,5,6. Parmi les caractéristiques exceptionnelles que possèdent ces matériaux, on peut souligner leurs caractéristiques catalytiques et thermiques exceptionnelles, ainsi que leur grande résistance, leur dureté et leur résistance à l'usure améliorée7, toutes données par leurs propriétés structurelles spécifiques. Ainsi, l'utilisation d'alliages nc pourrait représenter un impact significatif dans les secteurs où il est nécessaire d'appliquer des matériaux présentant ces caractéristiques particulières, tels que l'industrie aérospatiale ou aéronautique.

Au cours des dernières années, et poussé par la forte concurrence qui existe dans le domaine, le développement de nouveaux matériaux pour les applications aéronautiques a été considéré comme l'une des principales priorités de ce secteur8. Ainsi, de nombreuses recherches ont été menées pour répondre à cette problématique, mettant les efforts sur la recherche de matériaux permettant de réduire les coûts, tout en apportant une amélioration de leur comportement face à des conditions difficiles (résistance à l'usure et à la corrosion, tolérance aux dommages…)9, 10,11. Par conséquent, la sélection des éléments pour développer un nouvel alliage candidat est une étape critique qui doit être soigneusement considérée. Dans ce contexte, la technique de mécanosynthèse, qui permet de combiner des éléments difficilement ou impossibles à fondre par d'autres procédés conventionnels12, s'impose comme une méthodologie pertinente pour la production de nouveaux alliages. De plus, dans le cas des nanomatériaux métalliques, il a été prouvé que l'alliage élargit considérablement la plage de températures où le grossissement est inhibé, ce qui est l'un des effets néfastes que ces matériaux pourraient présenter lorsqu'ils sont constamment exposés à des températures élevées4,13,14. À cet égard, plusieurs alliages métalliques nc ont montré un comportement amélioré à haute température par rapport à leurs homologues en métal pur15,16.

En plus des caractéristiques mécaniques et physiques exceptionnelles que les alliages nouvellement développés devraient avoir pour permettre leur utilisation dans les domaines d'intérêt, leur sécurité humaine et environnementale doit être prise en compte. En fait, la toxicité de différents alliages métalliques pertinents largement utilisés dans différents domaines tels que le biomédical ou le militaire (fabrication de dispositifs médicaux, fabrication de munitions…)17,18 a déjà été évaluée à l'aide de méthodes in vitro et in vivo19,20,21, 22. Cependant, avec l'essor de l'industrie de la fabrication additive au cours des dernières années, l'utilisation de poudres métalliques est actuellement beaucoup plus répandue. Étant donné que les poudres métalliques peuvent être plus toxiques que leurs homologues en vrac23, la fourniture d'informations sur les conséquences possibles associées à leur manipulation et à leur gestion doit être considérée comme d'une importance cruciale, compte tenu également de la lixiviation potentielle due à leur détérioration et à leur dégradation.

Dans cette étude, trois alliages métalliques binaires de type nanograin produits par mécanosynthèse, présentant des caractéristiques prometteuses en termes de performances en conditions extrêmes et de faisabilité de fabrication, ont été évalués d'un point de vue toxicologique. Les alliages binaires suivants ont été sélectionnés : un alliage métallique léger résistant à la chaleur et à haute résistance pour les applications aéronautiques : TiAl ; et deux alliages métalliques résistants aux radiations pour les applications spatiales de protection contre les radiations : WAl et WCu. Par conséquent, l'impact biologique des poudres d'alliage de nc WCu, WAl et TiAl a été analysé en effectuant différents tests in vitro en utilisant deux organismes modèles qui ont été sélectionnés comme représentants des expositions humaines (lignée cellulaire A549) et environnementales (Saccharomyces cerevisiae). De plus, la toxicité potentielle des lixiviats d'alliages produits par ces matériaux a été étudiée dans la lignée cellulaire A549, ainsi que dans la bactérie bioluminescente Vibrio fischeri. Un mélange de poudre W-Cu de qualité commerciale à granulométrie standard (25 % en poids de Cu) a également été inclus dans les expériences. Dans l'ensemble, ce travail fournit des informations préliminaires sur la sécurité des différents alliages nc, fournissant des données précieuses pour aider à déterminer le candidat le plus approprié compte tenu de leurs propriétés dangereuses potentielles.

Trois alliages binaires nc ont été sélectionnés dans la présente étude pour leur évaluation toxicologique, en raison de leurs caractéristiques particulières et de leur application potentielle dans l'industrie aéronautique. Les propriétés de différents alliages nc WAl, dont un W80Al20 comme celui étudié dans ce travail, ont été décrites récemment, montrant que l'ajout d'Al entraînait une amélioration significative de la résistance au grossissement et de la frittabilité par rapport au tungstène commercial pur24. Concernant le nc WCu, les caractéristiques de cet alliage ont également été étudiées récemment25. Le W et le Cu sont des systèmes métalliques non miscibles qui peuvent être alliés par l'application d'un alliage mécanique, combinant les excellentes caractéristiques du W (hautes caractéristiques thermomécaniques et de protection contre les radiations) avec celles du Cu (haute conductivité thermique et électrique)12,26. Enfin, TiAl est une phase intermétallique où Ti et Al sont liés par des contraintes stoechiométriques. Les alliages de Ti sont largement utilisés pour la fabrication de composants structurels pour les avions, car ils présentent une résistance exceptionnelle ainsi qu'une résistance à la corrosion8.

La composition, la structure cristalline, la taille des particules et la lixiviation sont des facteurs qui peuvent influencer la toxicité des poudres d'alliage, étant SEM, XRD et ICP-MS très utiles pour évaluer ces paramètres. Par conséquent, les poudres d'alliage étudiées dans ce travail ont été caractérisées en appliquant les méthodologies mentionnées. Tout d'abord, la taille moyenne des cristallites des trois alliages nc (ncWCu, WAl et TiAl) a été calculée à l'aide de l'équation de Scherrer. Cette formule, efficace pour des cristallites de taille nanométrique, est basée sur les diagrammes DRX acquis sur les poudres alliées mécaniquement (matériel complémentaire, Figs. S1, S2, S3). La taille moyenne des grains de chaque échantillon est représentée dans le tableau 1, qui montre que les trois alliages nc étudiés présentaient des valeurs similaires.

SEM et SEM EDX ont été respectivement utilisés pour visualiser et analyser la composition élémentaire de toutes les poudres d'alliage (% en poids), y compris celles de l'échantillon WCu à granulométrie standard (sWCu). Étant donné que du ruban adhésif en carbone a été utilisé dans la préparation des échantillons, de faibles pourcentages de C ont été détectés dans chacun d'eux (≤ 8%), ainsi que de faibles pourcentages d'O, qui indiquent un faible degré d'oxydation de la surface. En plus de ces éléments, de faibles niveaux d'autres liés aux matériaux des moyens de broyage appliqués, tels que Ni ou Fe, ont été détectés dans les échantillons. Comme cet échantillon a été produit par le mélange des poudres des 2 éléments, le sWCu, comme attendu, s'est révélé hétérogène. Ainsi, différentes particules de W et de Cu ont été détectées, et également distinguées par microscopie électronique à balayage (Fig. 1). Concernant le ncWCu, les pourcentages de W et de Cu détectés étaient de 59,13 % ± 1,99 et 26,37 % ± 1,02 respectivement. Dans le cas des échantillons WAl et TiAl, les pourcentages des différents éléments détectés étaient de 89,18 % ± 1,80 de W et 3,78 % ± 0,43 d'Al dans le premier, et 77,18 % ± 3,24 de Ti et 13,95 % ± 2,23 d'Al dans le dernier. .

Morphologie des poudres métalliques. sWCu (A), (E); ncWCu (B), (F); WAl (C), (G) et TiAl (D), (H). Images (A), (B), (C) et (D) : Grossissement d'origine × 100 (barre d'échelle = 100 μm) ; Images (E), (F), (G) et (H) : Grossissement d'origine × 500 (barre d'échelle = 50 μm).

La morphologie des échantillons sélectionnés a été analysée et visualisée par MEB (Fig. 1). Dans tous les cas, une variété de particules, avec des tailles à l'échelle du micromètre, le plus souvent de quelques à plusieurs dizaines de micromètres, ont été observées. Les poudres de TiAl présentaient les particules de plus grande taille (Fig. 1D, H), tandis que les particules de WAl présentaient la plus grande hétérogénéité (Fig. 1C, G). Concernant leur forme et leur morphologie, les particules polygonales et rondes ont été distinguées dans tous les alliages nc. Dans le cas de sWCu, les particules W se sont révélées arrondies, formant des structures ressemblant à des agrégats et plus petites que les particules Cu, qui présentaient des formes plus anguleuses (Fig. 1A, E).

Par ailleurs, la présence des éléments composant les poudres sélectionnées a été évaluée dans des lixiviats obtenus après incubation des matériaux dans l'eau, à une concentration de 10 g/L, pendant 3 mois. Les niveaux de W et Cu ont été analysés dans les échantillons sWCu et ncWCu. L'alliage nc a montré qu'il libérait des concentrations plus élevées des deux éléments (W : 323 669,15 ppb ; Cu : 45 110,10 ppb) par rapport à l'échantillon de granulométrie standard (W : 119 101,26 ppb ; Cu : 4096,84 ppb). Dans le cas des lixiviats nc WAl, des niveaux de W inférieurs à ceux observés dans les deux échantillons de WCu ont été détectés (24 829 ppb), tandis que la concentration en Al détectée était faible (136,31 ppb). Enfin, l'alliage TiAl s'est montré moins susceptible de lixivier dans l'eau, puisque les teneurs en Ti et Al détectées étaient très faibles (Al : 11,27 ppb ; Ti : 0,23 ppb) par rapport à celles mesurées pour leurs éléments correspondants dans les autres alliages.

En résumé, les analyses de caractérisation physico-chimique ont révélé que les trois alliages nc étudiés ont des valeurs de granulométrie similaires, étant tous formés de particules à l'échelle micrométrique, avec une lixiviation variable.

La lignée cellulaire A549 a été utilisée comme modèle d'exposition humaine pour étudier les éventuels effets dangereux des alliages nc. Ainsi, la viabilité de cette lignée cellulaire après avoir été exposée à différentes concentrations des poudres métalliques, ainsi que la capacité de ces matériaux à déclencher un stress oxydatif, ont été évaluées. Les résultats obtenus dans le test de viabilité, qui a été analysé en effectuant le test d'absorption de rouge neutre, sont présentés sur la figure 2A. Une diminution statistiquement significative du pourcentage de cellules viables a été observée après leur exposition à 160 et 800 mg/L de poudres de ncWCu pendant 24 h, montrant des valeurs de viabilité de ≈ 70 % et ≈ 20 % respectivement. Dans le cas de l'échantillon de granulométrie standard, seule une diminution significative de ce paramètre a été observée lorsque les cellules ont été exposées à 800 mg/L (≈ 20%). Concernant les cellules A549 exposées aux poudres d'alliage WAl et TiAl nc, aucun effet négatif sur leur viabilité n'a été observé, indiquant que les deux matériaux sont sans danger pour cet organisme modèle dans les conditions testées.

Impact de l'exposition directe des cellules A549 à différentes concentrations des poudres métalliques. (A) Viabilité des cellules A549 (dosage Neutral Red). Les résultats sont exprimés en % du témoin (cellules non traitées). (B) Stress oxydatif (niveaux ROS) dans les cellules A549. Les résultats sont exprimés en tant que valeur de fluorescence relative par rapport au témoin (cellules non traitées) auquel a été attribuée une valeur de 1. Les données représentent la moyenne ± écart type, SD. Les différences ont été établies à l'aide d'une ANOVA à une voie suivie d'un test post hoc de Dunnett pour comparer chaque moyenne avec le contrôle, et considérées comme significatives à P ≤ 0,05. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001.

La capacité des matériaux sélectionnés à induire un stress oxydatif a également été évaluée dans la lignée cellulaire A549 en utilisant le DCFH-DA comme indicateur de la production de ROS (Fig. 2B). Les résultats obtenus montrent la production de stress oxydatif dans les cellules A549 après 1 h d'exposition aux poudres de ncWCu, les niveaux de ROS observés étant statistiquement significatifs aux deux concentrations les plus élevées testées (160 et 800 mg/L). Cependant, les cellules exposées au sWCu ont montré des niveaux statistiquement significatifs de stress oxydatif uniquement lorsqu'elles ont été incubées en présence de 800 mg/L, ayant des niveaux de ROS environ deux fois inférieurs à ceux induits par le ncWCu. De leur côté, les poudres WAl ont également augmenté significativement les niveaux de ROS des cellules A549, de manière clairement dose-dépendante, à partir de 32 mg/L. En revanche, les poudres de TiAl n'ont montré aucune capacité à induire un stress oxydatif dans les cellules A549, dans les conditions testées.

Le potentiel toxicologique des produits lessivés obtenus après l'incubation des poudres métalliques pendant 3 mois dans l'eau a également été évalué par les mêmes dosages utilisés pour effectuer les tests de contact direct. Comme le montre la figure 3A, seules les concentrations de lixiviats équivalentes à 800 mg/L des deux échantillons de WCu ont diminué la viabilité des cellules A549. Cet effet était plus important dans le cas des cellules exposées aux lixiviats de ncWCu, qui présentaient une réduction de ≈ 30 % de leur viabilité, tandis que les lixiviats de sWCu provoquaient une diminution de \(\approx\) 10 %. Les lixiviats des alliages WAl et TiAl se sont révélés sûrs dans toutes les conditions testées. En ce qui concerne leur capacité à induire un stress oxydatif (Fig. 3B), les deux lixiviats de WCu ont montré qu'ils induisaient des niveaux de ROS statistiquement significatifs à des concentrations équivalentes à 160 et 800 mg/L. Dans le cas des lixiviats de WAl, des niveaux de stress oxydatif significatifs n'ont été observés qu'à des concentrations équivalentes à 800 mg/L. Enfin, comme cela a été observé dans les déterminations par contact direct pour le TiAl, les lixiviats de ce matériau n'ont induit de stress oxydatif à aucune des concentrations testées.

Effets dans les cellules A549 après exposition à différentes concentrations des lixiviats de poudre. (A) Viabilité des cellules A549 (dosage Neutral Red). Les résultats sont exprimés en % du témoin (cellules non traitées). (B) Stress oxydatif (niveaux ROS) dans les cellules A549. Les résultats sont exprimés en tant que valeur de fluorescence relative par rapport au témoin (cellules non traitées) auquel a été attribuée une valeur de 1. Les données représentent la moyenne ± écart type, SD. Les différences ont été établies à l'aide d'une ANOVA à une voie suivie d'un test post hoc de Dunnett pour comparer chaque moyenne avec le contrôle, et considérées comme significatives à P ≤ 0,05. **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001.

L'utilisation généralisée des alliages métalliques dans une variété de domaines a rendu nécessaire leur évaluation toxicologique, où différentes lignées cellulaires ont été utilisées comme organisme modèle. Par exemple, la biocompatibilité des alliages de Ti appliqués dans la fabrication de dispositifs médicaux, tels que les implants dentaires ou orthopédiques, a été largement étudiée en utilisant des lignées cellulaires humaines distinctes obtenues à partir de différents tissus27. De même, la toxicité des alliages W, avec une utilisation accrue dans les applications militaires en remplacement du plomb dans la fabrication de munitions, a fait l'objet d'études à travers l'utilisation d'une variété de lignées cellulaires28. Outre la composition, la taille et la forme sont des facteurs importants qui affectent de manière critique la toxicité inhérente d'un alliage. Par exemple, dans le cas du Ti, les résultats expérimentaux ont montré que la poudre élémentaire de ce métal peut être sensiblement cytotoxique, tandis que le Ti en vrac est biocompatible23. Les auteurs ont expliqué les différences observées en faisant valoir que la concentration des ions libérés dans le milieu par les métaux élémentaires en vrac est significativement inférieure à celle libérée par la poudre, étant ainsi moins cytotoxique. Dans le présent travail, les alliages sélectionnés soumis à l'étude étaient sous forme de poudre, présentant des particules à l'échelle du micromètre. Compte tenu de leur capacité à réduire la viabilité cellulaire et à provoquer un stress oxydatif, les résultats ont montré que le ncWCu est l'alliage le plus cytotoxique, tandis que le TiAl est le plus sûr dans les conditions étudiées. Les résultats obtenus ont également indiqué une correspondance entre la sensibilité des matériaux à la lixiviation et leur toxicité associée : ncWCu était l'alliage libérant les niveaux les plus élevés de ses composants dans les lixiviats, tandis que TiAl lixiviait de très faibles niveaux de Ti et Al. De plus, les niveaux inférieurs de Cu et de W détectés dans le lixiviat de sWCu, par rapport à ceux détectés dans son homologue allié (la concentration de W et de Cu était ≈ 3 et ≈ 11 fois plus élevée dans les lixiviats de ncWCu que dans les lixiviats de sWCu, respectivement), pourraient également expliquent leurs différences de toxicité par rapport aux cellules A549. À cet égard, Palombella et al. ont analysé le potentiel cytotoxique des micro et nanoparticules de fer, de cobalt et de nickel de valence zéro dans les cellules souches adipeuses humaines, suggérant que les effets pervers que les microparticules produites pourraient être causés par la libération d'ions dans le milieu environnant, ou par la présence de ces particules autour des cellules, ce qui conduirait à une diminution de l'efficacité des échanges d'oxygène et de nutriments29.

Considérant que tous les lixiviats analysés dans ce travail, à l'exception de ceux de TiAl (ayant de très faibles concentrations de Ti et d'Al), peuvent provoquer un stress oxydatif et même la mort cellulaire (dans le cas des deux échantillons de WCu), on peut suggérer que les ions libérés jouent un rôle important dans la toxicité des matériaux étudiés. De plus, comme l'intensité de la réponse cytotoxique était plus élevée dans les expériences de contact direct, on peut supposer que les effets observés sont produits par une combinaison des ions libérés avec l'interaction directe des cellules avec les particules métalliques. À cet égard, il peut être souligné que certaines particules d'alliage métallique ont été décrites comme provoquant un stress oxydatif sans qu'il soit nécessaire de libérer des niveaux dangereux d'ions dans le milieu30,31.

Le potentiel toxicologique des alliages nc de composition différente a également été déterminé pour la levure Saccharomyces cerevisiae, un champignon unicellulaire adaptable largement utilisé comme modèle pour comprendre les mécanismes moléculaires dans les cellules eucaryotes32, ainsi que dans les études d'écotoxicologie33. La viabilité des cellules de levure après exposition à deux concentrations de matériaux différentes (800 et 8000 mg/L) et durées (2 et 24 h) a été analysée par la détermination des unités formant colonies (UFC) (Fig. 4).

Unités formant colonies (UFC) de cellules de S. cerevisiae exposées à différentes poudres métalliques à deux temps d'exposition (2 et 24 h) et à deux concentrations (800 et 8000 mg/L). Les résultats sont exprimés en pourcentage (%) d'UFC déterminées pour chaque condition d'exposition en utilisant comme valeur de référence la condition des cellules non exposées, à laquelle a été attribuée une valeur de 100 %. Les données représentent la moyenne ± écart type, SD. Les différences ont été établies à l'aide d'une ANOVA à une voie suivie d'un test post hoc de Dunnett pour comparer chaque moyenne avec le contrôle, et considérées comme significatives à P ≤ 0,05. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01.

À une courte durée d'exposition (2 h), aucune différence significative dans la viabilité de S. cerevisiae n'a pu être observée entre la condition témoin (cellules non exposées) et l'un des 4 échantillons testés aux deux concentrations. Cependant, lorsque le temps d'exposition a été augmenté (24 h), certaines différences de viabilité ont pu être observées entre les conditions étudiées. En particulier, une diminution significative de la viabilité des cellules de S. cerevisiae a été observée en présence de la concentration plus élevée d'alliages WAl et TiAl (P ≤ 0, 01 et P ≤ 0, 05 respectivement) pendant 24 h.

Le potentiel toxicologique des alliages présents dans les suspensions liquides a également été déterminé en étudiant leur capacité à induire la formation de ROS. Là encore, 800 et 8000 mg/L des différentes poudres métalliques ont été utilisées pour exposer les cellules de S. cerevisiae, pendant 2 h.

Comme le montre la figure 5, les différences de niveaux de fluorescence relatifs observés entre les cellules de S. cerevisiae exposées aux alliages distincts étaient mineures. À la concentration la plus élevée, les niveaux moyens de ROS les plus élevés ont été observés pour les alliages WCu et TiAl, mais ils n'étaient pas significativement différents de ceux observés pour le reste des conditions testées, y compris la condition de contrôle.

Analyse d'induction ROS de cellules de S. cerevisiae exposées à différentes poudres métalliques pendant 2 h à deux concentrations différentes (800 et 8000 mg/L). Les résultats sont exprimés en valeurs de fluorescence arbitraires. Les données représentent la moyenne ± écart type, SD. Les différences ont été établies à l'aide d'une ANOVA à une voie suivie d'un test post hoc de Dunnett pour comparer chaque moyenne avec le contrôle, et considérées comme significatives à P ≤ 0,05.

Alors que l'effet des métaux et des métalloïdes sur S. cerevisiae a été un sujet d'étude pour de nombreux chercheurs, générant des connaissances sur différents aspects de la biologie des métaux34, on sait peu de choses sur l'effet sur les champignons et autres micro-organismes de combinaisons métalliques spécifiques. Les résultats obtenus indiquent que la capacité à induire des dommages cellulaires par les différents alliages dans les cellules de S. cerevisiae, même en présence de très fortes concentrations, est très faible. Cela indique que les facteurs régissant la toxicité des métaux chez S. cerevisiae, tels que la concentration, la spéciation et l'état d'oxydation, sont d'une importance mineure dans le cas des alliages analysés. Par conséquent, en raison de la faible toxicité observée, nous avons décidé de ne pas effectuer d'analyses supplémentaires en utilisant des solutions de lixiviat d'alliages.

L'impact des alliages nc dans la bactérie marine V. fischeri a été évalué en surveillant la bioluminescence produite par ce micro-organisme en présence de lixiviats équivalents à 160 et 800 mg/L des différents matériaux. La figure 6 représente l'évolution de l'intensité lumineuse produite par les bactéries suivies sur une période de 30 min avec des intervalles de 5 min. Les courbes ont montré que tous les lixiviats ont provoqué une chute de ≈ 50 % du pic initial de bioluminescence, similaire à la chute observée dans le témoin d'inhibition (ZnSO4·7H2O). À partir de ce moment, la bioluminescence est restée constante dans les suspensions bactériennes exposées aux lixiviats WAl et TiAl, étant l'intensité lumineuse comparable à celle montrée par le contrôle (cellules non exposées) pour les deux concentrations testées après 20 min d'exposition. Dans le cas des bactéries incubées avec des lixiviats équivalents à 160 mg/L de sWCu, l'évolution de l'intensité lumineuse a été similaire à celle décrite pour les lixiviats TiAl et WAl, tandis qu'une diminution de la bioluminescence a été observée à une concentration équivalente à 800 mg/L. L après 30 min d'incubation (≈ 40% de luminescence en moins que dans le contrôle). Les lixiviats de ncWCu se sont révélés avoir un impact critique sur V. fischeri, car les deux concentrations utilisées pour réaliser l'expérience ont provoqué une baisse de l'intensité lumineuse similaire à celle observée dans le témoin d'inhibition (ZnSO4·7H2O), entraînant une perte complète de bioluminescence.

Impact des différents lixiviats de poudres métalliques dans la bioluminescence de V. fischeri lors d'une exposition de 30 min.

En raison de sa simplicité et de sa réponse rapide, ainsi que de la fiabilité et de la sensibilité des tests où elle est appliquée, la bactérie marine V. fischeri est un organisme utile pour étudier la toxicité de différents composés35. Par exemple, cet organisme bioluminescent a été appliqué pour évaluer le danger potentiel de différents métaux lourds et de leurs mélanges36, ainsi qu'en combinaison avec d'autres substances, telles que les hydrocarbures aromatiques polycycliques ou les acides humiques37,38. En ce qui concerne l'exposition de la bactérie marine à différents lixiviats métalliques, nos résultats ont montré que ceux dérivés de ncWCu, contenant de très fortes concentrations de Cu et de W, réduisaient considérablement son intensité lumineuse aux deux concentrations testées. Auparavant, il a été rapporté que 0,8 mg/L de Cu était capable d'induire une inhibition presque complète de la lumière émise par V. fischeri après 2 h d'exposition37. Par conséquent, la très forte concentration de cet élément détectée dans le lixiviat de ncWCu était probablement la principale cause des effets observés. Alors que Cu et W ont également été trouvés dans les lixiviats obtenus à partir de poudres de sWCu, les concentrations des deux éléments étaient beaucoup plus faibles, de sorte que la diminution de la luminescence de V. fischeri n'a été observée que lors de l'exposition à la concentration la plus élevée testée.

L'impact potentiel qu'un matériau nouvellement développé peut représenter pour la santé humaine et l'environnement est un problème qui doit être correctement pris en compte lors de sa phase de développement. Dans la présente étude, trois alliages binaires nanocristallins considérés comme des candidats prometteurs pour leur utilisation dans l'industrie aérospatiale, en raison de leurs propriétés difficiles dans des conditions extrêmes et de leur faisabilité de fabrication, ont été évalués d'un point de vue toxicologique. Ainsi, des poudres métalliques d'alliages WCu, WAl et TiAl nc et leurs lixiviats associés ont été analysés dans différents organismes modèles. De plus, un échantillon de poudre contenant un mélange W-Cu de granulométrie standard a été inclus dans les dosages. De manière générale, le TiAl s'est imposé comme l'alliage le plus sûr, puisque seules d'énormes concentrations de poudres ont entraîné des effets négatifs pour les cellules de levure, tandis que ni les lixiviats, ni les poudres n'ont produit d'effets nocifs sur le reste des organismes testés, à aucun des les concentrations évaluées.

Une relation semble exister entre la toxicité des alliages et leur susceptibilité à lixivier des éléments vers le milieu aqueux. Alors que de très faibles niveaux de Ti et d'Al ont été lessivés de l'alliage TiAl nc, qui s'est avéré être le matériau le plus sûr de ceux testés dans la présente étude, le ncWCu a montré une grande sensibilité à la lixiviation, étant également le plus toxique pour les cellules A549 et V. fischeri dans les conditions testées. De manière surprenante, cet alliage s'est révélé inoffensif pour la levure, où même à d'énormes concentrations, il n'entraînait ni diminution de sa viabilité, ni stress oxydatif. Dans l'ensemble, les résultats présentés fournissent une évaluation toxicologique préliminaire de différents alliages nc, indiquant que, d'un point de vue de la sécurité, le TiAl nc pourrait être un bon alliage candidat pour son développement et son introduction dans l'industrie.

La synthèse des poudres d'alliages nanocristallins utilisées dans ce travail pour effectuer des essais de toxicité a été réalisée dans les installations industrielles de MBN nanomaterialia par High Energy Ball Milling, en appliquant une technologie de procédé de synthèse mécano-chimique propriétaire (Mechanomade®). Des poudres métalliques de qualité industrielle de W, Al, Cu et Ti ont été utilisées dans les bonnes proportions pour obtenir la composition ciblée. Les systèmes W50Cu50, Ti75Al25 et W80Al20 ont été produits et nommés dans ce travail comme ncWCu, TiAl et WAl respectivement. Afin d'éviter au maximum l'oxydation de la poudre, le processus de mécanosynthèse a été réalisé sous atmosphère inerte d'Ar, qui a également été conservée lors du tamisage effectué pour éliminer les plus grosses particules, et lors du conditionnement. Pour diminuer la contamination, les matériaux de la chambre de broyage et des billes de broyage ont été différents pour chaque alliage binaire et pour chaque équipement de broyage. En particulier, les matériaux finaux utilisés étaient les suivants :

Système W-Cu : Billes en bronze et acier dur pour la chambre de broyage.

Système W-Al : Acier dur pour la chambre de broyage et la bille.

Système Ti–Al : Titane Grade 5 pour les billes et acier dur pour la chambre de broyage.

Un mélange de poudres de tungstène et de cuivre de qualité commerciale (25 % en poids de Cu) avec une granulométrie standard a également été utilisé dans les expériences. Cet échantillon a été nommé dans ce travail comme sWCu.

La microstructure des échantillons de poudres alliées mécaniquement a été caractérisée au moyen d'un diffractomètre XRD SIEMENS 5005, utilisant une cible de cobalt, dans les installations de nanomatériaux de MBN.

La composition de surface des poudres métalliques utilisées dans les essais de toxicité a été caractérisée de manière semi-quantitative en appliquant SEM-EDX. Un microscope JEOL JSM-6460LV équipé d'un détecteur à dispersion d'énergie X-MaxN a été utilisé dans les installations de l'Université de Burgos pour effectuer l'identification et la quantification des éléments des poudres métalliques. Au moins 3 zones différentes ont été sélectionnées au hasard pour effectuer l'analyse de chaque matériau.

La morphologie et la taille des particules ont été visualisées et analysées par Microscopie Electronique à Balayage. À cette fin, une petite quantité de chaque échantillon a été directement examinée à l'aide de JEOL JSM-6460LV à l'Université de Burgos.

Des suspensions aqueuses de poudres broyées (10 g/L) ont été préparées, à utiliser dans les expériences de contact direct à différentes concentrations. Avant chaque expérience, les stocks de poudres métalliques ont été homogénéisés en vortexant les échantillons à pleine vitesse pendant 1 min, en les soumettant à des ultrasons à faible intensité de puissance, et enfin en appliquant une étape de vortex supplémentaire.

Les lixiviats ont été obtenus en stockant des suspensions de poudres métalliques (10 g/L) à 4 °C pendant 3 mois. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés, et les surnageants ont été récupérés et filtrés à travers des membranes de polyéthersulfone 0,22.

Les éléments présents dans les lixiviats d'échantillons, obtenus après la filtration avec des membranes filtrantes en polyéthersulfone de 0,2 µm de la fraction aqueuse récupérée à partir de suspensions de poudres métalliques (10 g/L) incubées pendant 3 mois, ont été étudiés par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS ) à l'aide d'un instrument Agilent 8900 ICP-QQQ à l'Université de Burgos.

La lignée cellulaire de cancer du poumon A549 a été cultivée dans du milieu d'Eagle modifié commercial de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS) et de pénicilline 100 U/mL et de streptomycine 100 mg/L. Les cellules ont été incubées à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2.

La souche BY4741 de S. cerevisiae a été cultivée et maintenue dans un milieu YPD standard (extrait de levure 1 %, bacto-peptone de levure 1 %, glucose 2 %). Les cultures cellulaires en milieu liquide ont été incubées sur un agitateur rotatif à 185 tr/min à 30°C.

La bactérie bioluminescente Gram négatif V. fischeri NRRL B-11177 a été maintenue à température ambiante dans Marine Broth ou Agar 2216.

La viabilité des cellules A549 directement exposées à des poudres d'alliage nc a été évaluée en appliquant le test Neutral Red. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 3 × 104 cellules par puits et incubées 24 h après quoi les cellules ont été exposées à différentes concentrations des matériaux (6,4, 32, 160 et 800 mg/L) remis en suspension dans du milieu de traitement frais ( DMEM avec 1% FBS et sans antibiotique). Les cellules incubées avec le milieu de traitement seul ont été incluses dans les expériences en tant que témoins de cellules vivantes. Après l'exposition, les puits ont été lavés avec du DPBS et 100 µL d'une solution de Neutral Red (40 µg/mL) ont été ajoutés à chaque puits pendant 2,5 h. Cette solution a ensuite été jetée, les cellules ont été lavées une fois avec du DPBS et fixées pendant 2 min avec du formaldéhyde à 4 %. Les cellules ont été à nouveau lavées avec du DPBS et 150 µL d'une solution de libération de colorant contenant 50 % d'éthanol à 96°, 49 % de H2O distillée et 1 % d'acide acétique ont été ajoutés à chaque puits. Enfin, les plaques ont été agitées pendant 10 min et 100 μl de chaque puits ont été transférés dans une plaque opaque à 96 puits pour mesurer la fluorescence à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioTek Synergy HT, longueur d'onde d'excitation, 530/25 ; longueur d'onde d'émission 645/40) . Les résultats ont été exprimés en pourcentage du contrôle (fluorescence des cellules en l'absence d'alliages nc). Deux expériences indépendantes ont été réalisées, avec 3 répétitions biologiques par condition d'exposition dans chaque cas. Pour tester la toxicité des lixiviats, les cellules ont été exposées à différentes concentrations (lixiviats équivalents à 6,4, 32, 160 et 800 mg/L des alliages) pendant 24 h, et la viabilité cellulaire a été étudiée en appliquant le protocole expliqué ci-dessus.

Les cellules A549 ensemencées dans des plaques à 96 puits à raison de 3 × 104 cellules par puits ont été lavées avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sans rouge de phénol, puis incubées avec une solution de DCFH-DA (diacétate de 2ʹ,7ʹ-dichlorofluorescine) dans du HBSS (50 µM) pendant 30 min à 37 ° C dans l'obscurité. Après ce temps, les cellules ont été à nouveau lavées avec du HBSS, puis exposées à différentes concentrations de poudres d'alliage nc (6,4, 32, 160 et 800 mg/L) remises en suspension dans du HBSS, en utilisant comme témoins des cellules incubées avec du HBSS seul. Enfin, la fluorescence a été mesurée après 60 min d'incubation à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioTek Synergy HT, longueur d'onde d'excitation, 485/20 ; longueur d'onde d'émission 528/20). Deux expériences indépendantes ont été réalisées, avec 3 répétitions biologiques par condition d'exposition dans chaque cas. Le stress oxydatif induit par des lixiviats équivalents aux mêmes concentrations des alliages nc utilisés dans les expériences de contact direct a été analysé en appliquant le même protocole.

Des cellules de S. cerevisiae ont été pré-cultivées sur du milieu YPD dans un agitateur orbital (30 ºC et 185 tr/min) jusqu'à ce qu'une DO600 nm = 1 soit atteinte, puis elles ont été exposées à 800 ou 8000 mg/L des différentes poudres métalliques dans le même milieu de culture, ou en culture non exposée (témoin négatif), en plaques 24 puits (volume final de 1 mL). Par la suite, des échantillons de culture ont été obtenus après 2 et 24 h d'exposition. Pour déterminer les UFC aux deux temps d'échantillonnage, 100 µL de cellules ont été diluées 104 fois, en cas d'exposition de 2 h, et 105 fois, en cas d'exposition de 24 h, inoculées sur des plaques de milieu YPD solide (gélose à 6 %) et incubées à 30°C pendant 48h.

Le colorant CM-H2DCFDA a été utilisé pour quantifier les niveaux de ROS intracellulaires dans la levure, en utilisant un protocole similaire à celui décrit précédemment par James et al.39, récemment adapté par notre groupe de recherche40. En bref, les cellules de S. cerevisiae se développant en phase exponentielle ont été culottées, lavées et incubées avec du CM-H2DCFDA (7 µM) dans du DPBS pendant 60 min à 30 °C et 185 tr/min. Par la suite, les cellules ont été à nouveau lavées, remises en suspension dans du YPD et exposées aux différents échantillons (800 et 8000 mg/L) pendant 2 h. Ensuite, les cellules de levure ont été lavées deux fois avec du DPBS, incubées 2 min dans une solution contenant de l'acétate de lithium 2 M, lavées et incubées à nouveau pendant 2 min dans une solution contenant du SDS (0,01 %) et du chloroforme (0,4 %). Les cellules ont finalement été culottées et le surnageant transféré dans une plaque de micropuits noire opaque à 96, où la fluorescence a été mesurée (longueur d'onde d'excitation, 485/20 ; longueur d'onde d'émission 528/20) à l'aide d'un lecteur de microplaques (Synergy-HT, BioTek).

L'impact des lixiviats de poudre, équivalents à 160 et 800 mg/L, sur la luminescence produite par V. fischeri a été étudié en appliquant le test d'inhibition de la bioluminescence. En bref, une culture de 5 mL de Marine Broth 2216 inoculée avec une colonie luminescente a été incubée pendant 48 h à 15 °C. La suspension bactérienne a ensuite été centrifugée et le culot remis en suspension dans 5 mL de NaCl 2 % (p/v) et pré-incubé à 10 °C pendant 30 min avant le début de l'expérience. 90 µL de lixiviats remis en suspension dans une solution de NaCl à 2 % aux concentrations spécifiées ci-dessus ont été ajoutés à chaque puits dans des microplaques opaques à 96 puits. Des bactéries non exposées, remises en suspension dans du NaCl à 2 %, ont été incluses dans le test en tant que contrôle, pour surveiller l'atténuation de la lumière naturelle de ce micro-organisme, tandis que des cellules bactériennes incubées avec du ZnSO4·7H2O à 219,8 mg/L ont été incluses en tant que contrôle d'inhibition de la lumière. Pour réaliser l'expérience, 10 µL de la suspension bactérienne ont été ajoutés dans chaque puits, et la plaque a été incubée dans un Thermomixer (800 tr/min, 15 °C). La luminescence de chaque échantillon a été enregistrée à des intervalles de 5 min tout au long de 30 min dans un lecteur de microplaques (Synergy-HT, BioTek), étant le point de départ la valeur mesurée immédiatement après l'ajout des bactéries.

Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD. L'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post hoc de Dunnett pour établir des comparaisons entre chaque moyenne et le contrôle a été utilisée. Des tests statistiques ont été effectués à l'aide de Prism 6.0 (GraphPad Prism, GraphPad Software, Inc.), en considérant les différences significatives à P ≤ 0,05.

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Ce travail a reçu un financement des projets EU Horizon 2020 ICARUS (H2020-FETOPEN-2014-2015-RIA, convention de subvention N° 713514) et ICARUS-INAS (FETOPEN-03-2018-2019-2020, convention de subvention N° 946174). Nous remercions le Dr Gréta Gergely et Dániel Pethõ, de l'Université de Miskolc, pour nous avoir aimablement fourni les poudres WCu et pour leur aide précieuse.

Centre international de recherche sur les matières premières critiques-ICCRAM, Université de Burgos, Plaza Misael Bañuelos s/n, 09001, Burgos, Espagne

Carlos Rumbo, Rocío Barros, Sonia Martel Martín et Juan Antonio Tamayo-Ramos

MBN Nanomaterials SPA, 31050, Vasco Di Carbonera, TV, Italie

Alvise Bianchin

Département de génie mécanique, chimique et des matériaux, Université de Cagliari, via Marengo 2, 09123, Cagliari, Italie

Antonio Mario Locci

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CR et JATR ont conceptualisé l'étude. CR et JATR ont réalisé les expériences. CR, JATR, AB, AML, RB et SMM ont analysé et interprété les données. CR a rédigé le brouillon original. JATR, AB et AML ont participé à la rédaction. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Carlos Rumbo ou Juan Antonio Tamayo-Ramos.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Rumbo, C., Bianchin, A., Locci, AM et al. Évaluation toxicologique des alliages métalliques nanocristallins avec des applications potentielles dans le domaine aéronautique. Sci Rep 12, 1523 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-05406-5

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Reçu : 29 octobre 2021

Accepté : 11 janvier 2022

Publié: 27 janvier 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-05406-5

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